Методы исследования гемостаза
КОАГУЛОГРАММА – набор тестов, характеризующих функциональное состояние свертывающей и противосвертывающей систем крови. Полный набор коагулограммы включает от 7 до 20 тестов (Приложение 1), выбор которых зависит от многих условий с обязательным учетом результатов клинического обследования больного.
§ Оценочные тесты 1-го уровня –выполняются в КДЛ первичного звена: количество тромбоцитов, время (длительность) кровотечения, АЧТВ, ПВ (МНО), количество фибриногена по методу Клауса.
§ Оценочные тесты 2-го уровня –выполняются в лабораториях диагностических центров и стационаров: агрегация тромбоцитов, ТВ, D-димер (или РФМК), лизис эуглобулинов.
§ Дополнительные тесты –выполняют в специализированных лабораториях:
- при кровоточивости –активность фактора Виллебранда плазменных факторов свертывания (VIII, IX, XI, VII, X, V, II, HMWK, PK);
- при склонности к тромбозам –антитромбин, протеины С и S, аРС-резистентность, гомоцистеин, волчаночный антикоагулянт, антифосфолипидные антитела,генетическое тестирование (FV Лейден C1691Aб мутация гена протромбина G20210A).
В настоящее время в ряде лабораторий, в том числе крупных клинических центрах, продолжают выполнять анализы по малоценным, нестандартизированным методам, таким как время рекальцификации, толерантность плазмы к гепарину, этаноловая и протаминсульфатная пробы, оценка результатов протромбинового теста по промбиновому индексу и др. (таблица 1).
Таблица 1. Исторически устаревшие методы оценки гемостаза и их стандартизированные аналоги.
|
Метод исследования |
Недостаток |
Современный метод |
|
Подсчет количества тромбоцитов в мазке крови по Фонио (на 1000 эритроцитов). |
Низкая точность определений, но метод информативен при оценке морфологии тромбоци-тов в случае дифференциальной диагностики тромбоцито-патий |
Определение числа тромбоцитов в крови с помощью гематологи-ческого анализатора либо фазово-контрастной микроскопии в камере Горяева. |
|
Определение времени свертывания крови. |
Низкая стандартизация. |
АЧТВ. |
|
Определение времени рекальцификации. |
Низкая стандартизация |
АЧТВ. |
|
Аутокоагуляционный тест. (остается методом выбора в микропедиатрии) |
Отсутствие общепринятых аналогов. |
АЧТВ; определение активности АТ III. |
|
Фибриноген В, этаноловый тест, протаминсульфатный тест. |
Малоинформативное качествен-ное выражение результатов («+» или «-»), возможность получения ложных результатов |
Тесты на маркеры тромбинемии. Наиболее доступный – ОФТ с количественным выражением результатов. |
|
Определение толерантности плазмы к гепарину (на базе теста рекальцификации БТП). |
Низкая точность (нестандартизи-рованность ) и длительность определений, влияние на резуль-таты разнообразных нарушений внутреннего механизма свертывания. |
Оценка чувствительности плазмы к гепарину на основе тромбин-гепаринового времени свертыва-ния со стандартной активностью тромбина и гепарина. |
|
Концентрация фибриногена в плазме по Р.А.Рутберг ( грави-метрический вариант). |
Низкая стандартизация, возмож-ность ложного занижения резу-льтатов при гипофибриноген-емии и, наоборот, завышения при гиперфибриногнемии; гру-бое нарушение санитарных норм работы с плазмой крови. |
Концентрация фибриногена в плазме (хронометрический вариант по Клаусу) с использо-ванием коагулометра любой конструкции. |
|
Определение активности фактора XIII по крови по лизису фибринового сгустка в растворе 5М мочевины. |
Низкая чувствительность (выявляется только патология с активностью фактора 1-2% от N), влияние на результаты исследования концентрации фибриногена. |
Фотометрическое определение активности с применением специфических к фактору XIIIа субстратов (тест-системы “Berichrom FXIII”, “Dade Behring”, “Pefakit FXIII Incorporation Assay”, “Pentapharm” и др. |
В настоящее время в России опубликована современная номенклатура методов лабораторной диагностики нарушений гемостаза.
Условно эти методы могут быть разделены на следующие группы:
1. Клинико-функциональные пробы при исследовании сосудисто-тромбоцитарного звена системы гемостаза:
v Определение ломкости микрососудов с помощью пробы манжеточной компренссии (проба Кончаловского-Румпель-Лееде); определение времени кровотечения из микрососудов без дополнительной компенсации (проба Дьюка с проколом уха и др.), либо на фоне венозного стаза – проба Айви сдавливание плеча манжетой до 40 мм рт. ст. с проколами или надрезами кожи предплечья.
2. Лабораторные методы:
v измерение числа и функции тромбоцитов (адгезия и агрегация) путем микроскопии или с использованием гематологических анализаторов (при скрининговых исследованиях) и агрегометров.
v функциональные коагуляционные, или так называемые клоттинговые (по оценке времени свертывание мануально или с использованием коагулометров разных конструкций);
v измерение времени лизиса или растворения фибриногенового сгустка (при определении параметров фибринолиза);
v амидолитические (тесты с использованием хромогенных субстратов к тромбину, плазмину, фактору Xa, XIIa и др. и фотометров с фиксированной длиной волны измерения);
v иммунологические методы, позволяющие выявить уровень искомого антигена или антител при антифосфолипидном синдроме (АФС), гепарин-индуцированной тромбоцитопении (ГИТ) и др. преимущественно за счет иммуноферментных определений или на основе агглютинации частиц латекса;
v выявление генетических аномалий полимеразной цепной реакцией (ПЦР).
Для оценки плазменной системы гемостаза в КДЛ коагулогические исследования выполняются в основном двумя методами – клоттинговыми и хромогенными.
Клоттинговые(от англ. clot –сгусток) методы основаны на измерении промежутка времени с момента внесения реагента, запускающего ферментативный процесс свертывания плазмы (каскад реакций), до момента коагуляции – образования фибринового сгустка (нитей фибрина).
При скрининговых исследованиях системы гемостаза применяются клоттинговые методы – протромбиновый тест (ПВ, МНО, процент по Квику), концентрация фибриногена (по Клаусу, в г/л), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), тромбиновое время (ТВ), а также, при расширенном обследовании, – активность факторов II, V, VII, IX, X, XI, XII, активность антитромбина, активность системы протеина С. Для измерения времени образования сгустка в клоттинговых тестах используют приборы, называемые коагулометрами, анализаторами свертывания крови (АСК) или анализаторами показателей гемостаза (АПГ).Они бывают полуавтоматическими и автоматическими. В автоматических коагулометрах все элементы аналитического процесса выполняются без участия человека. В полуавтоматических анализаторах дозирование плазмы и реагентов осуществляет лаборант, а измерение времени образования сгустка и расчеты результатов анализа выполняет прибор. На основе принципа регистрации -момента выпадения сгустка - выделяют оптические, механические и оптико-механические типы коагулометров.
Хромогенные методы основаны на образовании окрашенных продуктов. Принцип реакции: хромогенный субстрат добавляют в реакционную пробу, он взаимодействует со специфическим ферментом (фактором свертывания), краситель высвобождается, и его количество измеряют фотометрически в интервале длин волн 405-410 нм. Существуют автоматические анализаторы, способные выполнять как клоттинговые, так и хромогенные исследования. Для контроля за использованием оральных антикоагулянтов существуют портативные коагулогические анализаторы (in point of care testing) – диагностика в месте наблюдения у постели больного, или так называемые МНО-детекторы – устройства, позволяющие осуществлять контроль МНО в домашних условиях. В некоторых лабораториях исследования системы гемостаза выполняется ручными методами с применением водяной бани (термостат с прозрачными стенками), все элементы аналитического процесса выполняет вручную лаборант. Ручные методы не позволяют обеспечить современные требования, предъявляемые к точности биомедицинских измерений. Кроме того, производительность таких исследований крайне мала.